Los mayores avances en biotecnología moderna se han dado en el área farmacéutica con la introducción de muchas e importantes proteínas terapéuticas y vacunas recombinantes. El éxito de tales productos ha hecho necesaria la búsqueda de mejores sistemas de expresión y métodos de cultivo eficientes a gran escala. Escherichia coli es el hospedero mas ampliamente usado para expresión de productos recombinantes, tanto de proteínas heterólogas como de ADN plasmídico (ADNp). No obstante, el escalamiento a fermentadores de gran escala de procesos de E. coli recombinante desarrollados a nivel laboratorio presenta grandes retos debido a la imposibilidad de reproducir en la gran escala todas las condiciones existentes en la pequeña escala. Como respuesta a este problema surgió el escalamiento descendente, que permite anticipar problemas inherentes en fermentadores de gran escala y desarrollar principios de escalamiento mas racionales y eficientes que los tradicionales. La inducción por aumento de temperatura es una estrategia que ofrece grandes ventajas en la manufactura de productos farmacéuticos, como por ejemplo ausencia de inductores tóxicos y caros. Sin embargo, limitaciones de transferencia de calor en fermentadores industriales ocasionan que el calentamiento sean mucho mas lento que a nivel laboratorio. Desafortunadamente, la información existente sobre problemas de termoinducción asociados a la escala es casi inexistente. Una excepción es el trabajo reciente de nuestro grupo de investigación (Caspeta et al. 2009) en donde demostramos que diferencias de inducción relacionadas a la escala del proceso tienen consecuencias importantes en la cantidad y calidad de una proteína recombinante y que tales diferencias también afectan distintas respuestas de E. coli a nivel transcripcional, en particular respuestas de estrés y choque térmico. Con base en tales resultados, en el presente proyecto pretendemos profundizar el conocimiento inicialmente generado y extenderlo a otro modelo de estudio mucho menos explorado, como lo es el ADNp. Además, basados en nuestros resultados previos pretendemos desarrollar un novedoso sistema de termoinducción que permita la síntesis de productos recombinantes en cultivo continuo simple, algo no posible hasta la fecha._x000D_ _x000D_ Específicamente, en el presente proyecto exploraremos estrategias de cultivo escalables de E. coli para la producción de vacunas de ADN. Se investigará la temperatura óptima de inducción de replicación de un plásmido que contiene origen de replicación de pUC, así como el efecto de tasas de calentamiento típicas de grandes fermentadores industriales. Se evaluará el contenido específico de plásmido y respuestas fisiológicas (viabilidad celular, velocidad de respiración, generación de CO2, acumulación de subproductos, rendimientos), además de la calidad del ADNp (superenrrollamiento). Se medirán niveles de transcripción de genes de las vías glucolítica, del ciclo de Krebs y de las pentosas fosfato, para entender las adaptaciones fisiológicas en la generación de energía y precursores del ADNp. Con ello buscaremos minimizar el efecto de choque térmico para mejorar la productividad del proceso. Finalmente, tal información se integrará en un sistema novedoso de cultivo de 2 compartimentos y se demostrará la factibilidad de realizar la producción continua de ADNp y de pre-pro-insulina (como proteína recombinante modelo) mediante la termoinducción intermitente, concepto surgido de nuestros trabajo previo.

Contribuciones del Proyecto_x000D_ Las contribuciones científicas del presente proyecto, se pueden resumir en cuatro grandes rubros:_x000D_ A) En primer lugar, pretendemos estudiar en detalle el efecto de la termoinducción en la producción y calidad de ADNp por cambios escalonados de temperatura. Aunque a la fecha se sabe que aumentos de temperatura pueden resultar en un incremento de la replicación de plásmidos tipo ColE1 o pBR322, no existen estudios exhaustivos como el propuesto aquí que hayan determinado condiciones óptimas de cultivo previo a la inducción y condiciones óptimas de inducción (incluyendo temperatura y tiempo de inducción). En este proyecto, a diferencia de los reportes existentes, se plantea abarcar un espacio experimental muy minucioso por medio de la metodología de diseño de experimentos y análisis de superficie de respuesta. Tales estudios no solamente generarán parámetros valiosos para desarrollar bioprocesos mas eficientes para la producción de ADNp, sino que aportarán información detallada de la fisiología de E. coli durante diferentes esquemas de termoinducción poco reportados en la literatura universal. Tal información será útil no solamente para el contexto de este proyecto, sino en cualquier situación en la que cultivos de E. coli estén expuestos a temperaturas superiores a las fisiológicas. En esta parte del proyecto se determinarán efectos sobre variables macroscópicas de la fisiología celular, tales como las velocidades de consumo de nutrimentos claves, tasas de respiración, viabilidad, producción de desechos metabólicos tóxicos, etc. así como efectos a nivel molecular, tales como los niveles de transcripción de genes claves en rutas del metabolismo central de carbono (vía glucolítica, ciclo de los ácidos tricarboxílicos y de la vía de las pentosas fosfato) y calidad de plásmido producido. Los estudios transcripcionales nos permitirán un acercamiento hacia el entendimiento de las adaptaciones fisiológicas para la generación de energía y precursores del ADNp Con ello se buscará minimizar el efecto de choque térmico generalmente observado con este tipo de estrategias, con la finalidad de mejorar la productividad del proceso._x000D_ _x000D_ B) La segunda gran contribución del presente proyecto radica en que será el primero a nivel mundial en el que se determine si existe algún efecto, positivo o nocivo, de llevar a cabo una termoinducción bajo condiciones típicas de biorreactores industriales. Dadas las grandes diferencias de transferencia de calor entre sistemas de cultivo de laboratorio y de gran escala, los resultados obtenidos en el laboratorio no pueden trasladarse directamente a la gran escala. Ya que sería impráctico y extramadamente costoso experimentar a nivel industrial para definir un bioporceos óptimo, la opción propuesta aquí sería la ruta mas racional para anticipar problemas del bioproceso asociado a la escala. En un trabajo reciente de nuestro grupo [16], fuimos los primeros en demostrar que en efecto las diferencias de termoinducción que existen entre escala laboratorio y escala industrial pueden tener consecuencias muy relevantes tanto para la fisiología celular como para la productividad y calidad de proteína heteróloga producida. Dado lo relevante y novedoso de tales resultados, ahora pretendemos extrapolarlos a un modelo biológico diferente como lo es el ADNp para el cual existe información limitada de bioprocesamiento, particularmente aquella relacionada al escalamiento._x000D_ _x000D_ C) Con base en los resultados obtenidos en las dos previas líneas de investigación, se generará información relevante a nivel molecular que pueda guiarnos en el diseño de nuevas cepas de E. coli recombinante para poder contender mejor con situaciones inherentes al cultivo de gran escala y poder desempeñarse de manera óptima, generando mas cantidad de producto y de mejor calidad. En el pasado reciente hemos demostrado la utilidad de este acercamiento para contender con problemas de gradientes de oxígeno disuelto y de concentración de glucosa, dos de los problemas que usualmente se presentan en cultivos industriales al alcanzar altas concentraciones celulares [10, 11, 15]. De esta forma anticipamos que seremos capaces de proponer el rediseño de rutas metabólicas específicas para canalizar mas esqueletos carbonados hacia la vía de síntesis de ADNp así como el de intervenir en vías específicas de respuesta a estrés (por ej., choque térmico) para evitar o minimizar efectos adversos del aumento de temperatura sobre la fisiología celular pero manteniendo los efectos positivos del aumento de productividad del ADNp._x000D_ _x000D_ D) Finalmente, el otro aporte importante que anticipamos es la realización de cultivos continuos para producir ADNp termoinducido. Ya que el aumento de la temperatura conduce necesariamente al cese del crecimiento y disminución de la viabilidad celular, todos los procesos termoinducidos están basados en procesos de dos etapas (lote o lote-alimentado), pero hasta la fecha ha sido imposible desarrollar métodos de cultivo continuo. Con base a nuestros resultados previos en la producción de proteína heteróloga termoinducida, hemos sido capaces de demostrar que es posible mantener un crecimiento adecuado en un sistema termoiducido si se hace a través de segregar la población en crecimiento de la población termoinducida. En esta última parte del proyecto pretendemos caracterizar exhaustivamente el efecto de la velocidad de crecimiento sobre dos modelos: producción de ADNp y pre-pro-insulina recombinante. La relevancia de esta parte del proyecto radica en que los cultivos continuos son por excelencia el estándar dorado para caracterizar el comportamiento de microorganismos y células de interés biotecnológico. Desafortunadamente, por lo explicado anteriormente, ningún proceso termoinducido había podido ser caracterizado por esta metodología tan poderosa. Con el sistema aquí propuesto, seremos los primeros a nivel mundial de lograr una caracterización de procesos termoinducidos a través de cultivos continuos. Los conocimientos generados permitirán el desarrollo de tecnología propia y el diseño informado de bioprocesos para la producción eficiente de la nueva generación de biomoléculas terapéuticas._x000D_ _x000D_ _x000D_ Además de las contribuciones científicas, en el presente proyecto estarán involucrados un buen número de estudiantes, principalmente de posgrado, por lo que otra de las contribuciones esperadas será la formación de recursos humanos de alta especialización en un campo poco desarrollado en México pero de grandes alcances y potencialidades._x000D_