Una tendencia generalizada dentro de las ciencias biológicas del siglo pasado ha sido el estudiar a los componentes celulares y sus funciones de manera independiente, dentro de un esquema que pudiera llamarse "reduccionista". Basado en dicho enfoque se ha podido generar conocimiento significativo dentro de cada una de las ramas de la Biología y se espera que el impacto de nuevas tecnologías permita que el reservorio informativo crezca aun con mayor velocidad bajo este enfoque. Claros ejemplos de ello se encuentran en la Genómica y en la secuenciación de organismos, o bien en la cuantificación masiva de los transcritos del organismo bajo condiciones específicas de crecimiento. ¿Qué conocimiento puede ser generado en base a esta información? ¿Podemos avanzar a una nueva etapa que integre las relaciones existentes entre los diferentes componentes del genoma y su estructura de tal manera que comprendamos que el DNA genómico no sólo codifica proteínas y moléculas de RNA, o es el blanco estático de proteínas reguladoras, sino que sus propiedades estructurales pueden jugar un papel clave en la regulación de la expresión genética? En este sentido, nuestro proyecto de investigación plantea la caracterización de la Curvatura Estática del DNA y la Energía de Desnaturalización de su doble hebra, como dos propiedades estructurales de los genomas que tienen un papel relevante en la regulación transcripcional de organismos bacterianos._x000D_ _x000D_ En una primera etapa nuestro proyecto plantea, mediante algoritmos computacionales de análisis, identificar aquellas regiones río arriba de unidades transcripcionales en los más de mil genomas secuenciados y en los más de cincuenta metagenomas cuya secuencia se encuentra disponible públicamente y que contengan valores estadísticamente significativos en términos de su Curvatura Estática y de su Energía de desnaturalización. Cabe mencionar que para lograr este objetivo con la mayor precisión posible, no solamente planteamos el uso de algoritmos computacionales desarrollados por otros grupos o por nosotros mismos en períodos pasados, si no que contemplamos la optimización y desarrollo de nuevos programas de análisis._x000D_ _x000D_ En una segunda etapa de nuestro proyecto, contemplamos corroborar experimentalmente algunas de nuestras predicciones in silico que consideremos como las más importantes. Para realizar dicha caracterización realizaremos estudios in vitro (caracterización de movilidad de fragmentos curvos en campos electroforéticos, mutaciones sitio específicas para abatir el grado de Curvatura Estática o la Energía de desnaturalización en regiones específicas de DNA, etc.,) e in vivo (fusiones transcripcionales a genes reporteros, cuantificación específica de mRNA mediante técnicas de RT-PCR, etc.,) tanto en organismos modelo (Escherichia coli, Bacillus subtilis), como en organismos que hayamos identificados como relevantes en términos de su contenido de regiones Curvas de DNA o que contengan una alta frecuencia de regiones de baja Energía de Desnaturalización dentro de regiones de regulación._x000D_ _x000D_ Una tercera y última etapa contemplará la integración de la información de las etapas anteriores para la realización de nuevos modelos de regulación que contemplen a las propiedades estructurales antes mencionadas, dentro de la red de regulación de los genomas bacterianos. _x000D_

Es ampliamente reconocido que la regulación transcripcional en bacterias está mediada fundamentalmente por proteínas reguladoras, también llamados Factores Transcripcionales (TFs)(1, 3, 32). La contribución del proyecto “Anáisis de la Energía de Desnaturalización y Curvatura Estática del DNA como elementos de la regulación transcripcional en Genomas y Metagenomas”, contempla generar una visión integral de la regulación transcripcional en organismos bacterianos al incluir, en adición de los Factores Transcripcionales, el papel de propiedades estructurales del DNA, Curvatura Estática y Energía de Desnaturalización del DNA en la regulación trascripcional de los genes. En etapas anteriores nuestro grupo ha restringido su estudio a organismos cuyo genoma ha sido secuenciado en su totalidad y básicamente al estudio de la Curvatura Estática del DNA. En el presente proyecto, contemplamos ampliar nuestro estudio para incluir, en adición a la Curvatura Estática, la caracterización de la Energía de Desnaturalización del DNA y actualizar nuestro análisis considerando a los más de 1,500 genomas secuenciados en su totalidad. Adicionalmente, nuestro estudio será extendido al también considerar a grupos de organismos bacterianos que comparten un mismo habitad mediante el estudio de secuencias metagenómicas. Esperamos que en estas secuencias metagenómicas se incluyan genes pertenecientes a nuevas vías metabólicas que previamente no habían podido ser caracterizadas por no encontrarse en el conjunto de genomas secuenciados de manera individual._x000D_ _x000D_ Con el objetivo de caracterizar regiones con Curvatura Estática de DNA mediante mutagénesis sitio específica, hemos desarrollado programas de cómputo que permiten realizar el diseño de oligos mutagénicos. Dichos programa son disponibles a la comunidad científica mediante la construcción de una página de Internet http://www.ibt.unam.mx/biocomputo/ en donde ya se encuentran caracterizadas las regiones de regulación de E. coli, como organismo modelo Gram-negativo. En esta nueva etapa consideramos extender nuestro estudio a la bacteria Bacillus subtilis, como organismo modelo Gram-positivo, al incluir los perfiles de Curvatura y Energía de Desnaturalización de las regiones de regulación de todas sus unidades transcripcionales. En este mismo sentido, los resultados de nuestro estudio metagenómico también serán incluidos en nuestro servidor web. Así mismo, planteamos desarrollar una herramienta de visualización que nos permite hacer un análisis de los elementos de regulación tanto predichos como conocidos que conforman la red de regulación, uno de los elementos que se incluirá son aquellas señales que indiquen la presencia de DNA Curvo o con una tendencia importante para que las hebras del DNA sean desnaturalizadas._x000D_ _x000D_ Cabe señalar que en nuestro grupo hemos realizado un importante esfuerzo a la optimización y desarrollo de nuevos algoritmos computacionales en la identificación de señales de regulación y predicción de unidades transcripcionales y operones bacterianos. Ejemplo de ello es el reciente desarrollo de un algoritmo para identificar operones basado en las distancias intergénicas de los genes y la relación funcional de sus correspondientes productos peptídicos de acuerdo a lo establecido en la base de datos STRING (23). Dicho algoritmo fue publicado en nuestro artículo High accuracy operon prediction method based on STRING database scores (37)._x000D_ _x000D_ A nivel experimental: Tomando como base los trabajos previos del grupo relacionado con la identificación teórica de señales de curvatura en sitios río arriba de operones o regulones, se diseñarán experimentos que determinen el papel de la señal de curvatura encontrada y su relación con la regulación del inicio de la transcripción sobre los genes pertenecientes a cada operón o regulón. Los genes que inicialmente caracterizaremos pertenecen al de los organismos modelo de Escherichia coli y Bacillus subtilis, para los cuales no existe reporte alguno en la literatura que relaciona al mecanismo de transcripción con la presencia de regiones curvas de DNA. De manera análoga al estudio de Curvatura Estática de DNA, desarrollaremos un algoritmo computacional que nos permita identificar aquellas mutuaciones puntuales que pudieran tener un cambio significativo en el valor de Energía de Desnaturalización dentro de regiones de regulación en estudio. Considerando los resultados del análisis teórico del algoritmo antes señalado, procederemos a efectuar las mutaciones sitio específico en la región de regulación genes que fueran identificados por poseer una región con valores particularmente bajos de Energía de Desnaturalización y cuantificar el efecto de dichas mutaciones._x000D_