El citoesqueleto es la red macromolecular de la célula formado por microfilamentos (MFs), microtúbulos (MTs) y filamentos intermedios (FIs). Esta red resulta esencial para la división celular, el transporte, la forma, el crecimiento y la respuesta a diversos estímulos bióticos y abióticos, incluyendo la interacción con microorganismos patógenos y simbiontes. Los MFs experimentan un recambio dinámico, esto es el intercambio de subunidades de actina a partir de filamentos existentes en los extremos barbados o +, por donde generalmente crece el filamento al mismo tiempo que el filamento se puede estar des-polimerizando en el extremo – o puntiagudo. Las funciones específicas de los MFs dependen de cómo se organizan, así como del efecto que ejercen las proteínas de unión a actina._x000D_ Los tubos polínicos y pelos radicales se caracterizan por un crecimiento polar, y presentan una organización particular de los MFs. Estos se reorganizan en forma de cables a lo largo de la célula hasta 5 µm antes del domo apical. El domo esta empacado con vesículas secretorias que se fusionan por exocitosis a la membrana y llevan los precursores para la síntesis de pared celular y crecimiento de la membrana para mantener el crecimiento polar. Se ha reportado que en esta región libre de cables de actina presenta una red muy fina de MFs involucrado en la liberación de las vesículas secretorias. La desestabilización ligera de los MFs con drogas que interfieren con su organización pueden no afectar el transporte de las vesículas pero si su liberación, esto puede inhibir el crecimiento y sugiere que los MFs juegan un papel esencial en el crecimiento polar._x000D_ El análisis de la organización de los MFs depende del desarrollo de nuevas sondas moleculares. Se han descrito algunas como talina, fimbrina, villlina, que fusionados con GFP pueden actuar como reporteros de la organización de los MFs, sin embargo, al sobreexpresarse también pueden inducir el engrosamiento anormal de los MFs y alterar algunos de los procesos básicos de la célula como el crecimiento polar._x000D_ Recientemente se caracterizó una proteína de unión a actina de levadura que es la Abp140. Esta proteína tiene en su región N terminal un sitio de unión a actina que consta de 17 aa y que cuando se fusiona a una proteína como las derivadas de las GFP (LifeAct-GFP) puede permitir la visualización de los microfilamentos in vivo. Este dominio ha demostrado ser altamente efectivo y al parecer no induce ningún artefacto con el tiempo en la organización de los MFs. Durante la formación del hilo de infección en un pelo radical que está siendo colonizado por un simbionte suceden dos cosas importantes. El crecimiento apical del pelo radical se inhibe y empieza a invertir el crecimiento, es decir, tanto la pared como la membrana se invaginan para dar lugar a la formación de un túnel o más bien conocido como hilo de infección, dentro del cual las bacterias se desplazan al interior del pelo y posteriormente atraviezan las células del córtex, hasta llegar al primordio en desarrollo. En el presente trabajo es de nuestro interés introducir el uso de GFP-LifeAct para estudiar la reorganización de los microfilamentos de actina en el hilo de infección desde su inicio en un pelo radical vivo hasta su paso a través de las células del córtex, asimismo complementaremos nuestras observaciones con la reorganización de los sitios de polimerización y las vesículas secretorias in vivo, algo aun no estudiado y fundamental de entender.

El estudio de los MFs de actina en células vegetales vivas siempre ha constituido un reto para la biología celular. Primeramente porque las fusiones de actina-GFP que funcionan adecuadamente en células vegetales, por alguna razón no identificada no funcionan en células vegetales. En segundo lugar la microinyección de compuestos fluorescentes como la droga faloidina acoplada a un fluoróforo para visualizar los microfilamentos resulta muy laboriosa y técnicamente muy demandante. Finalmente existen proteínas de unión a actina como la fimbrina, villina, talina, que presentan sitios de unión a actina y que se han utilizado de manera exitosa fusionadas a GFP para visualizar los microfilamentos en vivo de células vegetales. Sin embargo, dado que estos sitios de unión a actina son endógenos, es decir que se encuentran de manera normal en las células vegetales, cuando se sobre expresan pueden también inducir el engrosamiento de los microfilamentos, induciendo la formación de cables de actina sumamente gruesos que pueden incluso inhibir procesos básicos de la célula como es el crecimiento._x000D_ Recientemente en levadura se caracterizó una proteína de unión a actina que se le denomino Abp140. Esta proteína tiene en su región N terminal un sitio de unión a actina que consta de 17 aa y que cuando se le fusiona a una proteína como las derivadas de las GFP (LifeAct-GFP) puede permitir la visualización de los microfilamentos in vivo. Este dominio ha demostrado ser altamente efectivo para visualizar la dinámica de los microfilamentos de actina y al parecer no induce ningún artefacto en la organización de los MFs aun después de varias horas de sobreexpresión. La formación del hilo de infección en un pelo radical que está siendo colonizado por un simbionte es un proceso sumamente importante para una simbiosis exitosa. Durante este proceso el crecimiento apical del pelo radical se inhibe y empieza a invertir el crecimiento, es decir, tanto la pared como la membrana se invaginan para dar lugar a la formación de un túnel o más bien conocido como hilo de infección, dentro del cual las bacterias se desplazan al interior del pelo y posteriormente através de las células del córtex, hasta llegar al primordio en desarrollo en la región cortical de la raíz. El papel de los MFs es sumamente importante en el mantenimiento de la polaridad celular, los procesos de exocitosis y en la estructura celular, incluyendo la organización intracelular. Para que se pueda dar la formación del hilo de infección es necesario reorganizar el patrón de crecimiento del pelo radical y formar un nuevo patrón de crecimiento que necesariamente requiere de la participación del citoesqueleto. Estos procesos no han sido abordados y su estudio será esencial para entender los mecanismos moleculares que la controlan. La polaridad es un componente esencial dado que los hilos de infección tienen que sortear varias capas celulares antes de poder llegar a sus células blanco, donde por medio de una exocitosis regulada es capaz de liberar a las bacterias y estas a su vez endocitarse por la célula huésped._x000D_ En el presente trabajo es de nuestro interés introducir el uso de GFP-LifeAct para estudiar la reorganización de los MFs de actina en el hilo de infección desde su inicio en un pelo radical vivo hasta su paso a través de las células del córtex, asimismo es nuestro interés complementar nuestras observaciones con la reorganización de los sitios de polimerización. La determinación de cómo se reorganizan los sitios de polimerización a lo largo del hilo de infección nos permitirá entender como estos fenómenos pueden tener un efecto directo sobre la distribución y participación de las vesículas secretorias in vivo, tanto en el mantenimiento del crecimiento del pelo radical como del hilo de infección. La capacidad que tenemos hoy día de poder visualizar los MFs, las vesículas secretorias, microdominios lipídicos y los sitios de polimerización de actina de manera simultánea nos permitirán tener una idea integral del papel de los microfilamentos durante el establecimiento y mantenimiento de la elongación del hilo de infección. Los estudios aquí planteados contemplan realizar todos los experimentos in vivo lo cual es un reto metodológico bastante grande dada la dificultad para encontrar las células que forman los hilos de infección, sin embargo, es nuestro laboratorio tenemos estandarizados estos procesos mediante la inoculación de una cepa de Rhizobium que lleva un gen que codifica para la proteína GFP o RFP. Este conocimiento previo nos permite asegurar la viabilidad del proyecto y dada la originalidad del trabajo nos permitirá hacer contribuciones importante en el área de la interacción planta-bacteria._x000D_