La Reacción Acrosomal (RA) es un evento exocitótico que se lleva a cabo en el espermatozoide de muchas especies y es un requisito para la fecundación. El modelo tradicional propone que el inductor fisiológico de la RA es una (ZP3) de las cuatro glicoproteínas presentes en la capa externa del ovulo, llamada en su conjunto, zona pellucida o ZP. Evidencias recientes han cuestionado fuertemente este modelo, ya que experimentos de fecundación en donde se puede observar en tiempo real la penetración de un espermatozoide de ratón a su óvulo homologo, muestran que la RA ocurrió antes de que el espermatozoide hiciera contacto con la ZP. Interesantemente, previamente se habían reportado una serie de inductores de la RA cuya relevancia fisiológica no era clara ya que el espermatozoide encuentra este tipo de sustancias durante el trayecto en busca del óvulo, es decir, muy alejado del sitio de ocurrencia propuesto para la RA. A raíz de estas nuevas evidencias se vuelve importante retomar el papel fisiológico de estos inductores alternativos durante la fecundación ya que estas sustancias están presentes en el tracto genital femenino._x000D_ Es importante mencionar, que todos los inductores de la RA comparten el requerimiento de un aumento de Ca2+ intracelular. Sin embargo no se sabe sí los canales involucrados y las vías de señalización son compartidas o distintas. En este proyecto, proponemos realizar estudios con alta resolución temporal y espacial para caracterizar el aumento de Ca2+ inducido por los distintos agonistas de la RA y así contribuir a elucidar las vías de señalización involucradas con los diferentes inductores, analizar si son compartidas y si participan el mismo de tipo de canales de calcio en cada respuesta. Al momento solo existe un trabajo en el que se midió con alta resolución temporal el aumento de Ca2+ en respuesta a progesterona en espermatozoides de humano [1] involucrando al canal Catsper. El proceso de capacitación (ocurre en el tracto genital femenino) es un requisito para que ocurra la RA y aunque puede reproducirse in vitro, aproximadamente solo un 30 a 40% de la población se capacita, dificultando los estudios de RA que se realizan con una población heterogénea. Por lo tanto, en este proyecto también estableceremos la metodología para separar espermatozoides capacitados de no capacitados utilizando la técnica de FACS (Fluorescence activated cell sorting) aprovechando que se conoce que diversos parámetros intracelulares cambian durante la capacitación (concentración intracelular de diversos iones así como el pH). Contar con poblaciones separadas de espermatozoides capacitados nos será de gran utilidad para nuestros estudios._x000D_

El modelo descrito de la RA descrito en antecedentes, integra las evidencias obtenidas a lo largo de muchos años, sin embargo, este modelo ha sido cuestionado recientemente en varios aspectos, los cuales se resumen a continuación. _x000D_ 1. La función de la ZP3 como el inductor principal de la RA se ha puesto en duda. Experimentos utilizando un ensayo de penetración en filtro mostraron que la unión de los espermatozoides a la ZP y la presencia de ZP3 no son suficientes para inducir la RA, y se propuso un mecanismo mecano-sensorial como el responsable de inducir la RA [26]. Sin embargo, las conclusiones de este trabajo no contemplan la posibilidad de que la inducción sea el resultado de un estímulo combinado, es decir tanto el efecto mecanosensorial como la unión de ZP3 podrían ser necesarios para que el proceso sea más eficiente y/o alternativo para poder garantizar el éxito de la fecundación. La dificultad de obtener ZP3 nativa humana ha impedido la caracterización completa de este proceso. Proponemos continuar con el estudio de la respuesta que induce la unión de ZP3 a su(s) receptor(es) en el espermatozoide de humano utilizando las ventajas de que contamos con proteínas ZP recombinante y ovocitos humanos (gracias a la donación de la clínica INMATER)._x000D_ 2. Resultados del grupo del Dr. Arnoult cuestionan la participación de canales CaV3 en la RA por el hecho de que tanto ratones nulos para CaV3.1 como para CaV3.2 son fértiles [27]. El ratón nulo doble (CaV3.1 y 3.2) sería clave para demostrar que la compensación de uno por el otro rescata la función. El grupo de Arnoult tiene interés en desarrollar el ratón nulo doble y colaborar con nuestro grupo para la caracterización del mismo (este punto no se contempla realizar en el presente proyecto dado que su enfoque principal es en espermatozoide de humano)._x000D_ 3. Un canal de características similares a los CaVs se expresa de manera exclusiva en espermatozoides de algunos mamíferos, al cual se le denominó CatSper [28]. Ratones machos mutantes que carecen del canal CatSper son infértiles aún cuando sus gametos tienen morfología y motilidad (activada) normal, pero no presentan motilidad hiperactivada. Al parecer las cuatro isoformas de CatSper son necesarias para la movilidad hiperactivada [29], sin embargo, no se puede descartar que además de la hiperactivacion, éste canal participe durante la RA. En el caso de espermatozoides de humano el papel de los CaVs es aun menos claro que en ratón. Incluso muy recientemente se publicó que el canal CatSper de humano se activa por progesterona, propiedad que no está conservada para el caso del CatSper de ratón, abriendo nuevas preguntas sobre la participación de CatSper en la fisiología del espermatozoide de manera especie específica [1]. Proponemos re-explorar la participación de canales CaVs en la inducción de la RA con diferentes agonistas y antagonistas para canales CaVs y CatSper._x000D_ 4. La identidad molecular del canal de calcio responsable de la respuesta sostenida durante la RA, se ha asociado a los canales TRP por reportes de nuestro y otros laboratorios [30, 31]. Sin embargo, con el descubrimiento de las familias ORAI y STIM como componentes moleculares de la actividad tipo SOC, es probable que estas proteínas también podrían participar en la RA [32-35]. La primera familia llamada STIM, formada por dos miembros, parece funcionar como un interruptor molecular que le permite mediante una interacción proteína-proteína, comunicar a los canales de la membrana plasmática el estado de las pozas de Ca2+ y así activar la entrada de este ion desde el exterior de la célula [36, 37]. La segunda familia se llama ORAI y tiene tres integrantes, los cuales pueden formar por sí mismos canales con actividad tipo SOC. Además, estudios recientes sugieren que STIM1 y Orai pueden interactuar con proteínas TRPC y así determinar su función como canal SOC. El descubrimiento de éstas dos familias proponen una nueva definición de los canales SOC. Resultados del proyecto PAPIIT vigente (IN204109) indican la presencia de estas dos familias en espermatozoides tanto de humano como de ratón (datos no publicados). Estos canales son candidatos a participar en la RA inducida con los inductores que probaremos en el presente proyecto. Estudios de la cinética de los cambios de Ca2+ aunados a estudios farmacológicos nos ayudarán a identificarlos._x000D_ 5. Recientemente los experimentos de Jin y colaboradores condujeron a la propuesta de que la RA ocurre antes de que el espermatozoide haga contacto con la ZP [38]. Este grupo utilizó espermatozoides de un ratón genéticamente modificado, que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) en su acrosoma y la proteína roja fluorescente en sus mitocondrias, se observó en tiempo real la RA en espermatozoides expuestos a ovocitos rodeados de células del cumulus. Este trabajo demostró que muchos espermatozoides reaccionan en el cumulus y de manera importante, el espermatozoide que logra fecundar al óvulo fue en la mayoría de los casos, uno que ya no tenía acrosoma. Esto contradice el paradigma de que el inductor fisiológico de la RA es la ZP3, sin embargo estos datos provienen de un solo trabajo, en una especie en particular y no son suficientes para rebatir muchos años de estudio. Desde luego, abren preguntas muy interesantes y se pueden plantear nuevas hipótesis que conducen a proponer experimentos que nos permitan entender dónde ocurre la RA y la importancia fisiológica de los diferentes inductores. Utilizaremos ovocitos humanos para estudiar la interacción óvulo-espermatozoide y evaluaremos la inducción de la RA y la movilización de calcio inducida por inductores alternativos de la RA que por encontrarse en el tracto genital femenino, pudieran tener relevancia fisiológica. _x000D_ Por otro lado, es claro que durante la RA participan varios tipos de canales de calcio y ahora sabemos que la señalización por cambios en el Ca2+ no sólo importa la concentración sino también los componentes espacio temporales de estos cambios. Éste tipo de señalización puede involucrar la comunicación entre reservorios de Ca2+ en donde podrían participar al menos tres tipos de segundos mensajeros que provocan la liberación de Ca2+ de los reservorios intracelulares. Uno de ellos es el IP3 que reconoce a su receptor típicamente localizado en el retículo endoplásmico (RE). Otro es la ribosa cíclica ADP que reconoce receptores de rianodina también localizados en el RE. El tercero de los segundos mensajeros que liberan Ca2+ y el más potente, es el fosfato dinucleótido adenin ácido nicotínico o NAADP que induce la liberación de Ca2+ de reservorios ácidos como endosomas y lisosomas [39]. Se ha propuesto que este último facilita la comunicación entre reservorios y que ésta se establece cuando el NAADP induce una pequeña salida de Ca2+ de reservorios ácidos, que se amplifica por que es capaz de activar la liberación de Ca2+ inducida por Ca2+, es decir, esta primera salida de Ca2+, activa a receptores de IP3 o de rianodina, vaciando otros reservorios de Ca2+ y así amplificando la señal, funcionando como un disparador o gatillo de la señalización por Ca2+ [39]. El NAADP se sintetiza en respuesta a varios estímulos externos dependiendo del tipo celular a partir del NADP y ácido nicotínico mediante las ADPribosil ciclasas, enzima que ya se detectó en espermatozoides de erizo de mar [40]. Los efectos del NAADP en la movilización de los reservorios de Ca2+ se demostró en un principio en homogenados de ovocitos de erizo de mar [41, 42], pero por mucho tiempo no se tenía claro el blanco de este segundo mensajero. Recientemente, Calcraft y colaboradores describen a los canales de calcio de dos poros o TPC por sus siglas en inglés (Two Pore Channels) como receptores del NAADP [39]. Es importante destacar que los canales TPC, hasta el momento, solo se han detectado en reservorios ácidos y en la envoltura nuclear [43] El desarrollo de inhibidores específicos es fundamental para caracterizar cascadas de señalización, tal es el caso de la señalización de Ca2+ inducida por NAADP a través de la activación de los canales TPC. Naylor en el 2009 reportó que el NED-19 es un bloqueador potente de l