Las vasoinhibinas son una familia de péptidos derivados de la hormona prolactina que inhiben la angiogénesis y la vasodilatación, y promueven la apoptosis de células endoteliales. Estudios recientes apoyan la participación de las vasoinhibinas en la vascularización reducida del ojo, así como su posible participación en enfermedades oculares angiogénico-dependientes que incluye a la retinopatía diabética, la cual es la causa más frecuente de ceguera en los adultos a nivel mundial. Sin embargo, es poco lo que se sabe acerca de los mecanismos intracelulares que median las acciones vasculares de las vasoinhibinas tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Se ha mostrado que las vasoinhibinas pueden prevenir el efecto proangiogénico y vasodilatador del factor de crecimiento vascular y de la bradicidina, respectivamente, mediante la inhibición de la producción de oxido nítrico (NO) endotelial vía la regulación del calcio intracelular in vitro. Las características de las señales de calcio intracelular (amplitud, localización, duración etc.) inducidas por factores intra- y/o extracelulares conllevan a la ejecución de acciones como son la proliferación o la apoptosis. Asimismo, se sabe que el endotelio expresa varios tipos de canales membranales de calcio y diversas evidencias sugieren que los canales de calcio de tipo TRP ("Transient Receptor Potential") desempeñan un papel esencial en el control del influjo de calcio a las células endoteliales, con el fin potencial de controlar efectos vasculares como la angiogénesis. No obstante aún no se ha dilucidado la participación de estos canales en la señalización intracelular de las vasoinhibinas, y en particular en sus efectos antiangiogénicos mediante la inhibición de la vía de la bradicidina, la cual se ha encontrado sobre-activada en vítreos de pacientes con retinopatía diabética proliferativa en un estudio proteómico reciente. En este proyecto proponemos que las vasoinhibinas pueden ejercer sus acciones anti-angiogénicas por parte vía la inhibición de la proliferación endotelial inducida por la bradicidina (resultados preliminares), mediante la regulación de la homeostasis del calcio, y por ende del NO, a través de los canales TRP. Analizaremos si las vasoinhibinas inhiben la activación de la fosfolipasa C beta y la subsiguiente producción de inositol trifosfato (IP3) inducida por la estimulación del receptor de la bradicidina (mediante estuches comerciales). Además se sabe que poblaciones específicas de canales TRP pueden activarse por la liberación de calcio intracelular a través del IP3. Al respeto, hemos encontrado como resultado preliminar que la bradicidina (por 48 horas, a una dosis que estimula la proliferación endotelial) incrementa la expresión del canal TRPC5 por RT-PCR convencional en células endoteliales, y que las vasoinhibinas revierten dicho efecto. Queremos corroborar que se modifica la expresión del canal TRPC5 mediante las técnicas de RT-PCR en tiempo real y de Western-blot. Investigaremos si la inhibición de la expresión de los canales TRPC5 por ARN de interferencia (ARNi) previene el efecto inhibidor de las vasoinhibinas sobre el influjo de calcio inducido por bradicidina, a través de la técnica de medición de calcio intracelular por sonda fluorescente. Además, se conoce que el influjo de calcio puede regular la producción de NO por la sintasa endotelial (eNOS) al unirse a la proteína calmodulina. Por consiguiente, determinaremos si la inhibición de la expresión de los canales TRPC5, sugeridos por los experimentos de ARNi antes propuestos, previene el efecto inhibidor de las vasoinhibinas sobre la activación de la eNOS (método de citrulina radioactiva) y su fosforilación (Western-blot) inducida por bradicidina en células endoteliales in vitro. Asimismo, dependiendo de los resultados de los experimentos previamente mencionados, analizaremos si la inhibición de la fosfolipasa C (por el agente farmacológico U73122), la inhibición del influjo de calcio intracelular (por EDTA o heparina), el bloqueo de la expresión de los TRPC5 (por ARNi), y la inhibición de la actividad de eNOS (por L-NAME) previenen el efecto inhibidor de las vasoinhibinas sobre la proliferación endotelial inducida por la bradicidina (incorporación de timidina tritiada y ensayo colorimétrico) en células endoteliales en cultivo. Finalmente, proponemos evaluar si la bradicidina puede ejercer una acción proangiogénica en retinas de ratas inyectadas intravitrealmente con bradicidina, y determinar si las vasoinhibinas pueden inhibir dicho efecto in vivo (a través de determinar el número y densidad vascular mediante el sistema ScanScope). Estos experimentos nos ayudarán en determinar si el calcio intracelular a través de los canales TRPC5 media las propiedades antiangiogénicas de las vasoinhibinas, y nos permitirán comprender mejor los mecanismos de acción de las vasoinhibinas en condiciones normales y en la retinopatía diabética.

El estudio de los mecanismos que regulan la función vascular tiene implicaciones relevantes sobre padecimientos que se incluyen entre las principales causas de mortalidad (trastornos cardiovasculares y cáncer) e incapacidad (retinopatía diabética y artritis reumatoide) mundial. El presente proyecto pretende obtener información acerca de las bases moleculares de las acciones de las vasoinhibinas, una familia de péptidos con acciones vasoconstrictoras y antiangiogénicas. La demostración de que las vasoinhibinas tienen la capacidad de regular dos propiedades (avascularidad y sobrevivencia celular) esenciales para la funcionalidad de los vasos sanguíneos, refuerza su posible naturaleza como reguladores naturales del endotelio vascular. La mayor información sobre la acción de factores capaces de inhibir la angiogénesis brinda la posibilidad de comprender mejor ambos procesos y nos acerca al desarrollo de estrategias terapéuticas para el control de los padecimientos mencionados. El proyecto contribuye por una parte a reforzar una línea de investigación del laboratorio de la Dra. Carmen Clapp donde me encuentro laborando desde el fin de marzo 2007, centrada en las implicaciones funcionales de las vasoinhibinas con relevancia en la angiogénesis. Mi propia línea de investigación consiste en el estudio de las bases moleculares del efecto de las vasoinhibinas sobre la función vascular. Por lo tanto, dilucidar los actores moleculares y principalmente el papel del calcio intracelular en asociación con algunos subtipos de canales de calcio, los canales TRP como lo muestran mis resultados preliminares, en la función anti-angiogénica de las vasoinhibinas corresponde a mi propia temática, además de pertenecer al dominio de mi competencia. Finalmente, realizar este estudio en el contexto de la función vascular me permitirá desempeñar mi función como investigadora asociada y ampliar mi conocimiento sobre la regulación de señales de calcio por los canales TRP.