Antecedentes. Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno causan daño oxidante a lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Las especies reactivas de oxígeno se forman cuando el oxígeno molecular se reduce incompletamente para dar lugar a diversas especies como anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo. Por su parte la fromación de especies reactivas de nitrógeno se inicia con la síntesis del óxido nítrico (que en sí mismo es un radical) por la familia de enzimas conocida como sintasas de óxido nítrico. Cuando el óxido nítrico reacciona con el anión superóxido se forma una molécula muy reactiva llamada peroxinitrito. Las células cuentan con sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos que normalmente neutralizan dichas especies reactivas. Sin embargo, cuando las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno se producen copiosamente y rebasan la capacidad antioxidante de la célula se genera daño celular que se conoce como estrés oxidante, el cual esta asociado a muy diversas patologías. El consumo de frutas y verduras puede reducir la incidencia de enfermedades degenerativas como cáncer, problemas cardiovasculares y neurodegenerativos, inflamación y artritis. La presencia de compuestos fitoquímicos con actividad antioxidante en frutas y verduras está asociada a sus efectos protectores. En este proyecto estamos planteando estudiar si la inducción de enzimas de fase 2 contribuye al efecto protector de los compuestos fitoquímicos curcumina, sulforafano, -mangostina y ácido nordihidroguayarético (NDGA) en diversos paradigmas experimentales asociados a estrés oxidante. Entre las enzimas de fase 2 se encuentran diversas enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión reductasa (GR), glutatión peroxidasa (GPx), glutatión S-transferasa (GST), gama-glutamil cisteína ligasa (GCL), NADPH quinona oxidoreductasa (NQO1), hemo oxigenasa-1 (HO-1), etc. Se ha demostrado claramente que la curcumina y el sulforafano inducen la producción de enzimas de fase 2, contamos con datos preliminares para NDGA y aun carecemos de información para -mangostina. _x000D_ Objetivo general. Estudiar los compuestos antioxidantes derivados de plantas: curcumina, NDGA, sulforafano y -mangostina como protectores frente al daño oxidante en varios modelos experimentales y establecer si la inducción de enzimas de fase 2 están asociadas con su efecto protector._x000D_ Objetivos específicos. 1. Continuar los estudios sobre el mecanismo del efecto protector de la a-mangostina en cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo (NGC) y en corazón aislado de rata. De esta manera se da continuidad a los estudios realizados con el financiamiento otorgado por DGAPA en los tres años anteriores._x000D_ 2. En cultivos de células epiteliales de túbulo proximal de cerdo (LLC-PK1) estudiar si la preincubación con NDGA confiere citoprotección ante el estrés oxidante inducido por peróxido de hidrógeno (H2O2) y si dicha inducción está asociada con la estimulación del factor Nrf2 y de enzimas de fase 2 (como HO-1, NQO1, etc) así como con la disminución del estrés oxidante medido de diversas formas incluyendo especies reactivas de oxígeno y el contenido de glutatión reducido (GSH). _x000D_ 3. Determinar el mecanismo del efecto protector del sulforafano en la toxicidad inducida por cisplatino en estudios in vivo en ratas así como in vitro en células LLC-PK1._x000D_ 4. Estudiar si la curcumina es capaz de retardar la progresión del daño renal en el modelo de nefrectomía 5/6 en ratas y si este efecto está asociado con la expresión de enzimas antioxidantes y de la supresión del estrés oxidante y nitrante. Con lo anterior se piensa establecer una nueva estrategia para disminuir la progresión del daño renal la cual está basada en la inducción de enzimas citoprotectoras por un antioxidante dietario (curcumina) y así contribuir al desarrollo de nuevos tratamientos en pacientes con insuficiencia renal crónica._x000D_ 5. Estudiar si la curcumina es capaz de atenuar el daño estriatal inducido por ácido quinolínico en ratas, un modelo experimental de la enfermedad de Huntington y si este efecto está asociado con la inducción de enzimas de fase 2. También se realizarán estudios sobre el mecanismo de citoprotección de curcumina en cultivos de neuronas granulares de cerebelo (NGC)._x000D_ Métodos. Los modelos contemplados en este proyecto son: daño renal por nefrectomía 5/6, nefrotoxicidad por cisplatino, cardiotoxicidad por isquemia y reperfusión en corazones aislados y neurotoxicidad por ácido quinolínico. También se realizarán estudios en cultivos primarios de NGC y en células LLC-PK1|. La evaluación de la protección in vivo se realizará por el uso de diversas técnicas que evalúan daño funcional y estructural renal o estriatal: estudios de micropunción para valorar la hemodinámica renal, depuración de creatinina, concentración de nitrógeno de urea, actividad sérica de glutatión peroxidasa y la excreción urinaria de proteínas totales y de N-acetil-b-D-glucosaminidasa; cuantificación del daño tubular renal y estriatal por microscopía de luz y del daño estriatal por análisis de la conducta de rotación. El estrés oxidante se valorará por medio de diversas técnicas: peroxidación de lípidos, medición del contenido de carbonilos en proteínas (proteínas oxidadas), determinación de proteínas nitradas por inmunohistoquímica usando anticuerpos contra 3-nitrotirosina, determinación de GSH y determinación de H2O2. También se evaluará la actividad (por métodos espectrofotométricos) y/o expresión (por western blot y niveles de ARNm) de las siguientes enzimas: Cu,Zn-SOD, Mn-SOD, CAT, GR, GPx, GST, GCL, HO-1 y NQO-1. También se valorara la participación de la vía Keap1/Nrf2 mediante diversas determinaciones como inmunohistoquímica, medición de ARNm y western blot en fraccionamientos celulares _x000D_ _x000D_

La realización de este proyecto nos permitirá contribuir al estudio del mecanismo del efecto protector de algunos compuestos fitoquímicos con capacidad antioxidante en diversos modelos experimentales de enfermedades y de daño asociado a estrés oxidante tanto in vivo como in vitro. Los compuestos fitoquímicos que contemplamos estudiar en este proyecto son la curcumina, el suforafano, la -mangostina y el ácido nordihidroguayarético (NDGA). La curcumina es el principal componente de Curcuma longa, se localiza principalmente en los rizomas y es el causante del color amarillo de esta planta. Este compuesto es utilizado como una especia en la dieta que proporciona el color amarillo y sabor característico al curry. El sulforafano es un isotiocianato que resulta de la hidrólisis enzimática del glucosinolato llamado glucorafanina, la cual está presente en los vegetales de la familia Cruciferae especialmente los pertenecientes al género Brassica como el brócoli. La -mangostina es una xantona que se aísla de la fruta del mangostán (Garcinia mangostana Lin) que es un árbol tropical de hoja perenne de crecimiento lento pertenece a la familia Guttiferae. La fruta de este árbol tiene una cáscara gruesa, de color marrón rojizo hasta violeta-púrpura, en el interior se encuentra la pulpa de color blanco, textura blanda, sabor agridulce y refrescante. El NDGA se encuentra en alta concentración en las flores, las hojas, tallos verdes y pequeños tallos leñosos de la planta Larrea tridentata (conocida en México como gobernadarora o chaparral). Además de estudiar el mecanismo por medio del cual estos compuestos fitoquímicos ejercen su efecto protector, la contribución de este proyecto consiste en tratar de establecer en diversos modelos experimentales la importancia de los antioxidantes en la dieta en al prevención de enfermedades. Los modelos contemplados en este proyecto son: daño renal por nefrectomía 5/6, nefrotoxicidad por cisplatino, cardiotoxicidad por isquemia y reperfusión y neurotoxicidad por ácido quinolínico. También se realizarán estudios en cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo y en células epiteliales de túbulo proximal renal. Particularmente estamos interesados en estudiar la participación de la inducción de enzimas de fase 2 en dicha respuesta protectora. Entre las enzimas de fase 2 se encuentran diversas enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa, glutatión reductasa, glutatión peroxidasa, glutatión S-transferasa, gama-glutamil cisteína ligasa, NADPH quinona oxidoreductasa, hemo oxigenasa-1, etc. La inducción de estas proteínas de fase 2 se realiza de manera coordinada vía el factor de transcripción Nrf2 que interactúa en los sitios regulatorios de los genes con los sitios conocidos como elementos de respuesta antioxidante (ARE). Por esta razón estudiaremos la participación del factor Nrf2 en los paradigmas experimentales contemplados en este proyecto.