El objetivo central de este proyecto es la identificación y caracterización funcional de aquellas proteínas del frijol que cambien su estado de fosforilación (se fosforilen o defosforilen) durante las etapas iniciales de la interacción simbiótica Phaseolus vulgaris-rizobia, utilizando un enfoque fosfoproteómico. La identificación de las proteínas fosforiladas, se llevará a cabo mediante el fraccionamiento de extractos proteicos con columnas de afinidad IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) para fosfoproteínas, su separación por medio de geles 2D y su identificación por medio de espectrometría de masas. El grado de fosforilación de las proteínas identificadas se cuantificará por diferentes métodos (tinción específica o por medio de western blots); las que presenten el mayor grado de cambio, serán sujetas a posteriores estudios bioquímicos (fosforilación in vitro, sobreexpresión de proteínas mutantes nulas y obtención de proteínas constitutivamente activas) y de genética reversa (silenciamiento génico usando RNA de interferencia) para determinar su función en la vía de señalización de la nodulación durante las etapas iniciales. Con todo lo anterior y con datos reportados en la literatura, se podrá proponer un modelo de la red de señalización durante las etapas tempranas de la nodulación utilizando varios programas de libre distribución como el Cytoscape._x000D_ _x000D_

El proyecto pretende contribuir al conocimiento de frontera en el área de las interacciones planta-microorgasnismo,específicamente con la identificación y caracterización molecular de proteínas fosforiladas en raíces de frijol, después del tratamiento con los FN específicos a tiempos cortos, utilizando la fosfoproteómica como estrategia para lograr dicho objetivo. La identificación y purificación de las proteínas fosforiladas se llevará a cabo con una estrategia novedosa que nos permitirá de manera directa su fraccionamiento y enriquecimiento a partir de un extracto proteico total, tomando ventaja de la afinidad que presentan las proteínas fosforiladas por los iones metálicos a pH ácido. Para lograr ésto, las fosfoproteínas se obtendrán pasando por una columna HiTrap IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) FF (GE Healthcare) precargada con iones metálicos de Hierro (III) y se eluirán de la misma con el buffer correspondiente. Estas fosfoproteínas se separarán por geles 2D, se identificarán por espectrometría de masas y su grado de fosforilación se cuantificará por diferentes métodos (tinción específica o por medio de western blots). Con estas fosfoproteínas se llevarán a cabo estudios bioquímicos (fosforilación in vitro, sobreexpresión de proteínas mutantes nulas y de proteínas constitutivamente activas) y de genética reversa (silenciamiento mediante RNA de interferencia) para determinar su participación en la vía de señalización disparada por los FN en las etapas inciales de la simbiosis frijol-rizobia. Con todo lo anterior, proponemos construir un modelo de la red de señalización con la ayuda del programa Cytoscape, que es de _x000D_ libre distribución._x000D_ En reportes previos, se ha descrito en la literatura la identificación de fosfoproteínas en dos de las leguminosas modelo (Medicago truncatula y Lotus japonicus) durante la nodulación, sin embargo en estos estudios las fosfoproteínas no se purificaron por afinidad ni se separaron por geles de dos dimensiones (Wan et al., 2005; Larrainzar et al., 2007). Por tanto, consideramos que la estrategia que proponemos facilitará la identificación de proteínas fosforiladas implicadas en la red de señalización de la nodulación a tiempos cortos. Además nuestra propuesta incluye la caracterización bioquímica y funcional de las proteínas identificadas y seleccionadas para tal fín._x000D_ _x000D_ _x000D_