INTRODUCCIÓN Rhizobias es el nombre común con el que se denomina a un grupo de bacterias Gram-negativas, ubicadas taxonómicamente dentro de la división de las alfa proteobacterias, dentro del orden rhizobiales y agrupadas dentro de la familia rhizobiaceae. En esta familia se encuentran los géneros Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium y Bradyrhizobium (Weir, 2006). La característica distintiva de estas bacterias es su capacidad para fijar el nitrógeno atmosférico en simbiosis con plantas leguminosas. Rhizobium etli es la bacteria más abundante en suelos de América latina donde se siembra fríjol, la cepa mejor caracterizada de esta especie es la CFN42, aislada de nódulos de raíces de fríjol cultivado en Guanajuato, México (Martínez-Romero, 2003). Su genoma, totalmente secuenciado en el Centro de Ciencias Genómicas (CCG) de la UNAM, está constituido por un cromosoma circular de 4.3 Mb y seis plásmidos denominados p42a (194.2 kb), p42b (184.3 kb), p42c (250.9 kb), p42d (371.2 kb) p42e (505.3 kb) y p42f (642.5 kb). En suma, los plásmidos representan el 32% del genoma total (González et al., 2006) (http://www.cifn.unam.mx/retlidb/). Desde hace varios años nuestro grupo de investigación ha estado interesado en identificar funciones codificadas en los plásmidos, importantes para la simbiosis y para la vida saprofítica de esta bacteria. Una de las principales contribuciones de nuestro grupo fue la obtención de una colección de mutantes derivadas de la cepa parental CFN42, las cuales carecen de cada uno de sus plásmidos. El estudio de estas mutantes en diferentes condiciones de cultivo, nos llevaron a descubrir que la mutante que carece del plásmido p42f(642.5 kb), presenta una severa deficiencia de crecimiento en un medio químicamente definido o comúnmente llamado medio mínimo (MM), constituido por una fuente de carbono (succinato), una fuente de nitrógeno (NH4Cl) y sales minerales(MgSO4, K2HPO4, CaCl2, FeCl3). ANTECEDENTES Con la finalidad de identificar la(s) función(es) codificada(s) en el plásmido p42f necesarias para el crecimiento de la bacteria en medio mínimo, iniciamos una búsqueda en la secuencia del genoma de esta bacteria, de proteínas codificadas en el replicón p42f cuya función pudiera estar asociada con el crecimiento en MM. Encontramos dos proteínas, cuya función pudiera ser catalizar dos distintos pasos de la síntesis de la vitamina pantotenato. La relevancia del pantotenato para cualquier célula, radica en que esta vitamina forma parte de la molécula coenzima A (CoA). La CoA y sus tio-ésteres (acetil-CoA, malonil-CoA, succinil-CoA, etc) son esenciales para el metabolismo de carbono, síntesis de proteínas y metabolismo de lípidos (Leonardi and Jackowski, 2007). Reportes en la literatura indican que mutantes auxótrofas de pantotenato recuperan total crecimiento con la adición de pantotenato en un rango de 1 a 10 uM. Para el caso de de la mutante que carece del plásmido p42f solo se logró una complementación parcial de su crecimiento después de la adición de concentraciones muy altas de pantotenato (500 uM). Nuestras hipótesis para explicar este comportamiento son que R. etli CFN42 tiene un transporte muy deficiente de pantotenato por lo cual su adición al MM no complementa totalmente su crecimiento, o que el posible transportador de alta afinidad está codificado en el mismo plásmido del cual carece, o bien que además de pantotenato, requiere de otras moléculas para crecer, cuya síntesis está también codificada en el plásmido p42f. Estos resultados nos llevaron a profundizar en el estudio de la vía de síntesis de pantotenato en R. etli CFN42, lo cual nos permitió observar diferencias importantes con respecto a la vía de síntesis y transporte descrita para enterobacterias, grupo en el cual la síntesis de esta vitamina ha sido estudiada con mucho detalle. La primera diferencia importante la encontramos en la reconstrucción de la vía de síntesis de pantotenato realizada con el programa computacional pathway tools (http://bioinformatics .ai. sri. com/ptools/). De acuerdo con esta predicción bio-informática, las posibles enzimas que participan en la síntesis de esta vitamina en R. etli CFN42 se encuentran distribuidas en tres replicones de sus seis replicones, lo cual contrasta con la localización cromosomal de enterobacterias. La segunda diferencia importante proviene de los análisis de similitud, de acuerdo a los cuales, en el genoma de R. etli CFN42 está ausente un ortólogo del gene panF. En E. coli, PanF es una proteína que se encarga de co-transportar pantotenato y sodio al interior de la célula. La tercera diferencia importante también proviene de los análisis de similitud, los cuales indican que en el genoma de R. etli CFN42 no existe un ortólogo de panD, este gene en enterobacterias codifica para una aspartato 1-descarboxilasa la cual cataliza la descarboxilación de L-aspartato para producir beta-alanina. Debido a que esta molécula es un precursor de pantotenato, mutantes de E. coli en panD requieren de beta-alanina o pantotenato para crecer (Cronan, 1980). De acuerdo con la base de datos de KEGG (http://www.genome.ad.jp/ kegg/kegg2.html) la ausencia de una aspartato 1-descarboxilasa típica de bacterias no es solo una peculiaridad de R. etli CFN42, sino que está ausente en ocho de las 11 rhizobias secuenciadas a la fecha. Basados en la reconstrucción de vías metabólicas hecha por KEGG, la única posible vía de síntesis de beta-alanina en todas las rhizobias que carecen de PanD, sería por medio de la degradación de uracilo. Lo importante de este hecho es que hasta ahora, se ha considerado como un dogma que la síntesis de beta-alanina en bacterias proviene únicamente de la reacción catalizada por PanD, lo cual no parece cumplirse en algunas rhizobias. También es interesante mencionar que la síntesis de beta-alanina a partir de la degradación de uracilo hasta ahora se considera una vía de síntesis exclusiva de plantas (Duhaze, 2003; Mazus, 1972; Raman, 2004). Es importante resaltar la posibilidad de que una nueva isoforma de la enzima aspartato 1-descarboxilasa, hasta ahora no descrita en bacterias, esté presente en algunas rhizobias. METAS Y RELEVANCIA DEL PROYECTO Con base en los antecedentes arriba mencionados, el presente proyecto pretende demostrar experimentalmente, que en el plásmido p42f de R. etli CFN42 está codificada parte de la vía de síntesis de pantotenato. Esta investigación es relevante ya que tradicionalmente, se ha considerado que las funciones esenciales para el crecimiento bacteriano están codificadas en el cromosoma y no en los plásmidos. De hecho las definiciones más ortodoxas han considerado que los plásmidos únicamente confieren resistencia a las bacterias cuando enfrentan condiciones ambientales adversas como la presencia de metales pesados, antibióticos, etc. La secuencia completa de los genomas de esta y otras bacterias y su análisis comparativo y funcional, están permitiendo ampliar el concepto de los plásmidos y tener un mejor entendimiento de su papel en la biología de los microorganismos. En este sentido, una de las contribuciones del presente proyecto es reforzar este nuevo concepto de plásmido, demostrando experimentalmente, que en R. etli la síntesis de pantotenato, un compuesto esencial para el funcionamiento celular, requiere de la cooperación funcional de distintos replicones. Adicionalmente, por medio de la caracterización funcional de la vía de síntesis y transporte de pantotenato en R. etli CFN42, pretendemos resolver el enigma de cómo sintetizan beta-alanina las rhizobias, ya sea por una vía distinta a la descrita hasta ahora en enterobacterias, o por una isoforma de aspartato 1-descarboxilasa desconocida hasta ahora en bacterias. También pretendemos demostrar que las rhizobias poseen un sistema de transporte de pantotenato distinto al PanF típico de enterobacterias. REFERENCIAS 1. Cronan, J. E., Jr. 1980. β-Alanine synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 141:1291–1297. 2. González, V., R. I. Santamaría, P. Bustos, I. Hernández-González, A. Medrano-Soto, G. Moreno-Hagelsieb, S. C. Janga, M. A. Ramírez, V. Jiménez- Jacinto, J. Colla

Los resultados iniciales del presente proyecto sugieren que en el plásmido p42f de Rhizobium etli CFN42, están codificadas una o más funciones relacionadas con el metabolismo central de esta bacteria. Este hallazgo es importante ya que tradicionalmente, se ha considerado que las funciones esenciales para el crecimiento bacteriano, están codificadas en el cromosoma y no en los plásmidos. De hecho las definiciones más ortodoxas han considerado que los plásmidos únicamente confieren resistencia a condiciones ambientales adversas como la presencia de metales pesados, antibióticos, etc. Nuestras primeras investigaciones acerca de las funciones codificadas en los plásmidos de R. etli CFN42, han propuesto que la vida saprofítica de esta bacteria depende de la información genética presente en ambos tipos de replicones (Brom et al, 1992). La secuencia completa de los genomas de esta y otras bacterias y su análisis comparativo y funcional, están permitiendo ampliar el concepto de los plásmidos y tener un mejor entendimiento de su papel en la biología de los microorganismos. En este sentido, una de las contribuciones del presente proyecto es reforzar este nuevo concepto de plásmido, demostrando experimentalmente, que en R. etli la síntesis de pantotenato, un compuesto esencial para el funcionamiento celular, requiere de la cooperación funcional de distintos replicones. Una de las hipótesis de este proyecto es que existen algunas diferencias importantes entre E. coli y Rhizobias en cuanto a la síntesis y transporte de pantotenato. En este contexto, otra de las contribuciones de este proyecto será proponer un modelo distinto de síntesis y transporte de pantotenato al paradigma previamente establecido por estudios en enterobacterias. Hasta ahora no se ha demostrado que las bacterias puedan sintetizar beta-alanina utilizando una vía alterna a la descarboxilación de aspartato, si demostramos en R. etli la ausencia de una actividad de aspartato 1-descarboxilasa y la síntesis de beta-alanina por la degradación de uracilo significaría una muy importante contribución al estudio de la genética, bioquímica y evolución de este grupo de bacterias. Una contribución igualmente importante será descubrir que las rhizobias poseen una nueva isoforma de aspartato 1-descarboxilasa ya que hasta ahora no se han reportado enzimas distintas a PanD que catalicen la misma reacción. La predicción bio-informática de la vía de síntesis de pantotenato en R. etli indica que existen dos posibles enzimas IlvE y dos posibles enzimas PanB. Como parte de las contribuciones de este proyecto, pretendemos determinar cual de las copias es funcional, o si ambas se requieren para la síntesis. Estos datos serán de gran relevancia para tener perfectamente caracterizada, desde el punto de vista genético, la síntesis de pantotenato en esta bacteria. Adicionalmente, las mutantes que se deriven de este estudio permitirán contribuir a estudiar si es posible la simbiosis entre una mutante de R. etli deficiente en síntesis de pantotenato y su planta hospedera Phaseolus vulgaris. Debido a que las plantas sintetizan pantotenato surge la pregunta ¿Puede la planta suministrar pantotenato o CoA a esta mutante y permitir que se lleve a cabo la simbiosis? Hasta ahora se desconoce si la planta puede darle a la bacteria algo más que ácidos di-carboxílicos y glutamato.