Síntesis del proyecto La generación de un individuo mediante la reproducción sexual depende de la comunicación adecuada entre el espermatozoide, el óvulo, y el ambiente que los rodea. Este diálogo a distancia maximiza las probabilidades de encuentro óvulo-espermatozoide. La difusión de componentes provenientes de la capa externa del óvulo establece un gradiente de concentración que reconoce el espermatozoide homólogo, y resulta en una relocalización hacia el centro del gradiente con la finalidad de establecer el origen de la fuente. Este proceso denominado quimiotaxis está distribuido de manera amplia entre diferentes especies de organismos marinos y mamíferos. Sin embargo, los mecanismos celulares y las diferentes estrategias reproductivas no se conocen del todo. Uno de los pasos indispensables para caracterizar los mecanismos que participan en la quimiotaxis es el análisis del movimiento celular por medio de un análisis estadístico de sus desplazamientos. En la vida real, el espermatozoide se desplaza de manera tridimensional, sin embargo, hasta la fecha, el estudio de movilidad del espermatozoide se ha llevado a cabo en 2 dimensiones, pudiéndose observar únicamente aquellos que nadan pegados a una superficie de vidrio. Esto se debe básicamente a la complejidad que presenta la adquisición de los datos de movimiento en tres dimensiones por la velocidad a la que se desplazan estos microorganismos (aprox. 250 micras/seg) y a la velocidad de su batido flagelar (40hz aprox). El presente proyecto pretende el desarrollo de un sistema de segmentación, seguimiento y análisis 3D del movimiento del espermatozoide al nado libre, tanto a nivel de su trayectoria como al nivel del flagelo. Asimismo, pretendemos desarrollar un método que permita correlacionar cambios en la concentración de calcio intracelular, que se sabe que están asociadas al estímulo quimiotáctico, con los cambios en su movilidad tridimensional, tanto a nivel de su desplazamiento global como a los cambios flagelares. El sistema estará basado en el sistema de adquisición de pilas tridimensionales de imágenes (3D+t) desarrollado recientemente con éxito por nuestro grupo con apoyo de PAPIIT (Corkidi et al, 2008), proyecto que recibió recientemente la distinción Imaging Solution of the Year (Advanced Imaging, 2008).

Contribución del proyecto El papel fundamental del espermatozoide, célula altamente especializada, es entregar su material genético al óvulo femenino de su correspondiente especie. Inherentemente, esta función requiere que el espermatozoide detecte la presencia del óvulo, nade hacia él y lo fecunde. El rastreo o seguimiento de este tipo de células en tres dimensiones es una tarea ambiciosa. El principal obstáculo para registrar sus trayectorias ha sido la alta velocidad a las que estas células flageladas se mueven en un espacio tridimensional (30-200 M/s, Nascimento et al, 2008; Miller, 1985). Mientras que el movimiento helicoidal del espermatozoide ha sido observado de manera cualitativa desde hace mucho tiempo (Jennings, 1901), Hiramoto et al, 1978 comparó de manera cuantitativa por primera vez la velocidad y el diámetro de trayectorias 2D enfocando el microscopio en dos niveles diferentes (cerca de la superficie y a 300 micras de ésta). Más tarde, Crenshaw, 1990 reportó el primer sistema capaz de realizar el seguimiento de trayectorias 3D de espermatozoides individuales para análisis cuantitativo. Esto lo realizó adaptando la tecnología propuesta por Berg, 1978 para microorganismos de nado lento, en donde se mantenía enfocado de manera automática en el centro del campo microscópico el microorganismo a seguir. El sistema propuesto por Crenshaw estaba formado por dos cámaras de video adaptadas a dos microscopios orientados perpendicularmente entre sí. Un microscopio proveía coordenadas x,y mientras que el otro proveía x,z. Enfocando los microscopios al centro de un volumen de líquido, las imágenes eran grabadas y analizadas imagen por imagen para determinar sus coordenadas 3D. Sobre las trayectorias adquiridas se presentaron datos cuantitativos de velocidad, curvatura y torsión para espermas individuales (Crenshaw, 2000). Asimismo, la teoría matemática del movimiento helicoidal y de la quimiotaxis con simulaciones fue reportada posteriormente (Crenshaw, 1993a; Crenshaw, 1993b; Crenshaw, 1993c; Crenshaw, 1996; Crenshaw, 2000; Friedrich, 2007). En base a estos antecedentes, recientemente nuestro grupo de trabajo desarrolló el sistema reportado en Corkidi et al, 2008, el cual es capaz de adquirir secuencias de ‘pilas’ tridimensionales de imágenes (3D+t) a velocidades que permiten obtener toda la información tridimensional de las trayectorias de los espermatozoides al nado libre. El sistema desarrollado tiene la capacidad de adquirir ‘pilas’ de al menos 60 imágenes, a razón de 70 ‘pilas’ por segundo (para poder analizar un volumen de líquido en 100 micras de profundidad), lo que implica una velocidad de adquisición y de control del dispositivo de enfoque de 4,200 imágenes por segundo. Para lograr esto, se utilizó un dispositivo piezo-eléctrico montado entre el objetivo del microscopio y el microscopio mismo, el cual permite la visualización sincronizada de diferentes planos focales que son adquiridos con una cámara de video de alta velocidad. Como se mencionó en los antecedentes, con este sistema pudimos ver las primeras trayectorias en forma de hélice que describían los espermatozoides del erizo de mar y pudimos comparar tanto su velocidad como su radio de curvatura promedio cuando éstos nadaban confinados a una superficie de vidrio ó libremente. La extracción de los datos 3D de las pilas de imágenes fue realizada de manera manual. Para esto, se localizaba un espermatozoide en una de las imágenes de la pila, posteriormente, el mismo espermatozoide era localizado de manera visual en la siguiente pila de imágenes para así obtener sus coordenadas espaciales. Este tedioso procedimiento nos permitió obtener los datos requeridos. Sin embargo, tuvimos que descartar ~80% de éstos debido a la dificultad y el consumo de tiempo durante el análisis (Corkidi et al, 2008). La primera fase de este nuevo proyecto pretende el desarrollo de algoritmos automáticos de segmentación, seguimiento y análisis de múltiples trayectorias 3D descritas por los espermatozoides en una misma muestra. Por una parte, proponemos adaptar el filtro de Kalman (De Feo et al, 1997) para el rastreo automático (descrito en la sección de métodos) y los algoritmos necesarios para discernir entre trayectorias cruzadas de espermatozoides. Este sistema será el primero a nivel internacional en poder integrar tanto los algoritmos de adquisición de datos 3D a velocidades requeridas para análisis de espermatozoides, como los algoritmos para el rastreo o seguimiento automático de los mismos. En una segunda fase, pretendemos desarrollar un sistema de microscopía de epi-fluorescencia con dos cámaras de sensibilidades diferentes que nos permita correlacionar la dinámica los cambios en la [Ca2+]i que están involucrados en la regulación del nado del espermatozoide en un espacio en 3D. Esto lo lograremos acoplando al sistema desarrollado previamente (Corkidi et al, 2008) una cámara que nos permita obtener la señal proveniente de los cambios en la intensidad de fluorescencia del colorante de Ca2+ Fluo-4 empleado como reportero de los cambios en la [Ca2+]i experimentados por los espermatozoides cargados con dicho colorante. De esta manera la cámara rápida nos proporcionará la información posicional del espermatozoide, mientras que la cámara de fluorescencia revelará la dinámica de los cambios en la [Ca2+]i de manera simultánea. Esto será una innovación importante que tendrá implicaciones inconmensurables en el entendimiento de los mecanismos de navegación mediante los cuales el espermatozoide puede fecundar al óvulo. Así mismo este sistema puede ser empleado para estudiar los procesos intracelulares de diversos organismos que navegan en un ambiente tridimensional impactando diversas aéreas de interés en ciencia básica y aplicada. Finalmente, en una tercera fase, proponemos el diseño de la metodología necesaria para poder estudiar la morfología de la dinámica flagelar en tres dimensiones. Cabe mencionar que hasta la fecha, este estudio sólo se ha realizado en dos dimensiones, por lo que los datos que se obtendrán, integrados además a la posición 3D del espermatozoide (y sus respectivas imágenes funcionales de calcio intracelular) serán sin duda de gran relevancia tanto para el campo de Visión por Computadora como para el campo de la fisiología celular y de la fecundación. En cuanto a la formación de recursos humanos, este proyecto conformará el tema de tesis doctoral del estudiante Arturo Pimentel (tutor Dr. Gabriel Corkidi), quien ha sido recientemente aceptado en el posgrado de Ciencia e Ingeniería de la Computación. Así mismo, este tema formará parte de la tesis doctoral del estudiante Adán Guerrero (tutor Dr. Alberto Darszon) quien recientemente fue admitido al posgrado de Ciencias Bioquímicas, UNAM.