Síntesis del proyecto_x000D_ En la mayoría de los animales hay una clara distinción entre las células germinales, que sirven para la reproducción del organismo, y las células somáticas que cumplen una multitud de funciones. Todas las células germinales provienen de las células germinales primordiales (CGP), cuyo destino se determina temprano en el desarrollo del organismo (Gilbert 2010). Se conocen dos estrategias para que se lleve a cabo la segregación de las CGP: en la primera estrategia que es utilizada por mamíferos y salamandras; las CGP son inducidas por interacciones intercelulares durante la etapa de gastrulación, esta estrategia involucra productos sintetizados después de la fertilización, en contraste con la segunda estrategia que es utilizada por organismos como D. melanogaster, C. elegans , X. laevis y D.rerio; la cual se basa en la producción de RNAs mensajeros y proteínas que son depositadas durante la ovogénesis en un estructura que se conoce como plasma germinal (revisado por Wylie 1999). Después de la fertilización las células a las que se segrega el plasma germinal durante las primeras divisiones celulares serán las que se convertirán en las CGP. El citoesqueleto y proteínas que regulan su dinámica como son las Rho-GTPasas parecen jugar un papel fundamental en este proceso. _x000D_ Las Rho-GTPasas son una familia de proteínas pequeñas que participan como interruptores en la regulación de múltiples procesos celulares. Ciclan entre un estado inactivo , en unión a GDP y un estado activo unido a GTP. En su estado activo pueden reconocer a sus efectores y generar una respuesta hasta que el GTP se hidroliza (Etienne- Manneville & Hall, 2002). En mamíferos la familia de las Rho-GTPasas esta compuesta por 16 miembros pero solo se dispone de información funcional de Rac1, CDC42 y RhoA. Rac1 y CDC42 forman complejos con proteínas del citoesquelto como son la tubulina, actina, tau e internexina y la proteína Staufen (Villace et al 2004). Se sabe que Staufen participa en el transporte de RNAs en el desarrollo temprano de Drosophila (Czaplinski & Singer 2006). RhoA también ha sido implicada en la localización de RNAs mensajeros a través de la vía de RhoA/Rock/Miosina en fibroblastos en cultivo (Stuart et al 2008)._x000D_ En el presente proyecto se estudiará la participación de las Rho-GTPasas en particular de RhoA, en la segregación temprana del plasma germinal en pez cebra, ya que experimentos realizados previamente en el laboratorio han demostrado la colocalización de RhoA con componentes de plasma germinal durante la ovogénesis. Además de que RhoA coincide en los septos de división celular en el desarrollo temprano donde de manera normal se localizan los RNAs del plasma germinal a diferencia de otras Rho-GTPasas como son Rac1 y CDC42 que se localizan en el citoplasma en los mismos estadios del desarrollo del pez cebra._x000D_ Inhibiremos la actividad de RhoA en ovocitos y en embriones tempranos y caracterizaremos el efecto que esto tienen en la localización del plasma germinal. Este trabajo nos permitirá profundizar en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que participan en el proceso de segregación de componentes esenciales para la formación de la línea germinal._x000D_

Contribucion_x000D_ La distribución y localización de las macromoléculas se encuentra altamente organizada, se han descrito numerosos ejemplos de RNA mensajeros con localización específica desde levadura hasta el humano; esto indica que la localización molecular es un proceso conservado evolutivamente y marca la importancia del proceso de segregación de componentes celulares. Se ha propuesto que los componentes que intervienen en un proceso biológico en común (vía de señalización, ruta metabólica etc.) se asocian físicamente formando complejos macro-moleculares altamente estructurados con una localización subcelular espacio-temporal específica; de lo contrario esto puede promover el desarrollo de diferentes tipos de patologías., _x000D_ El proceso de segregación de los componentes celulares es tan importante que participa durante el desarrollo embrionario en diferentes procesos como son: la definición de los ejes dorso-ventral y antero-posterior; migración y adhesión celular, la división asimétrica y en la plasticidad sináptica entre otros. Se sabe también que participa en la determinación de linajes celulares como es el caso de la línea germinal durante la segregación de lo que se conoce como plasma germinal. El plasma germinal,el cual es un grupo particular de proteínas y RNAs mensajeros, se segrega de manera muy específica desde la ovogénesis y sigue patrones muy característicos durante el desarrollo embrionario temprano. El estudio de segregación de RNAs del plasma germinal durante la ovogénesis y el desarrollo temprano permitirá entender este proceso a mayor profundidad._x000D_ El citoesqueleto y proteínas que regulan su dinámica como son las Rho-GTPasas parecen jugar fundamental en este proceso. Las Rho-GTPasas son una familia de proteínas pequeñas que participan en la regulación de múltiples procesos celulares, como es la regulación génica, la apoptósis y la remodelación del citoesqueleto, entre otros; y se encuentran conservadas evolutivamente desde levadura hasta los humanos. En el humano hay 16 miembros de esta familia, sin embargo los mas estudiados han sido Rac1, CDC42 y RhoA. Existe evidencia que apoya la hipótesis de que las Rho-GTPasas participan en el transporte de RNAs tal es el caso de Cdc42 y Rac1que forman parte de complejos con proteínas del citoesqueleto y con la proteína Staufen; la cual se sabe participa en el transporte de RNAs en el desarrollo temprano de Drosophila y en neuronas de organismos adultos. Por otra parte RhoA ha sido implicada en la localización de RNAs mensajeros en seudópodos en células tumorales y en fibroblastos en cultivo; mediando la vía de ROC/ROCK/miosinaII. En el presente proyecto se estudiará la participación de las Rho-GTPasas, en particular de RhoA, en la segregación temprana del plasma germinal durante la ovogénesis y desarrollo temprano en pez cebra. _x000D_ En el laboratorio contamos con una colonia de peces cebra que producen semanalmente alrededor de 2000 embriones, tenemos el equipo necesario para realizar inyecciones, cultivo de los embriones y de los ovocitos, tenemos montando los protocolos para in situ tanto en cortes como en embriones completos, al igual que para la detección de proteínas tanto por western blot como en embriones completos. Contamos con las sondas que reconocen diferentes componentes del plasma germinal de pez cebra como son vasa, nanos dazl y dead-end, además de contar con anticuerpos que reconocen de manera específica a la proteína RhoA en pez cebra. Todo lo anterior nos permitirá realizar el trabajo necesario para profundizar en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que participan in vivo en el proceso de segregación de RNAs a regiones específicas dentro de la célula._x000D_